عرض مصدر تتابع الحمض النووي الريبي RNA

{{مقالة غير مراجعة|تاريخ = ديسمبر 2019}}
[[ملف:Summary_of_RNA-Seq.svg|تصغير|500x500بك| ''ملخص RNA-Seq.'' داخل الكائن الحي ، يتم نسخ الجينات وتقسيمها (في [[حقيقيات النوى|كائن حقيقي النواة]]) لإنتاج نسخ مرنا ناضجة (أحمر). يتم استخراج مرنا من الكائن الحي، مجزأة ونسخها إلى مستقر [كدنا] (الأزرق). والتسلسل وس-كدنا] باستخدام [[تسلسل الحمض النووي|الإنتاجية العالية]]، وأساليب التسلسل قصيرة المقروءة. يمكن بعد ذلك [[تراصف تسلسلي|محاذاة]] هذه التسلسلات إلى تسلسل الجينوم المرجعي لإعادة بناء مناطق الجينوم التي تم نسخها. يمكن استخدام هذه البيانات لتوضيح مكان وجود الجينات المعبر عنها ومستويات التعبير النسبي وأي متغيرات لصق بديلة.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|الأخير=Shafee|الأول=Thomas|الأخير2=Lowe|الأول2=Rohan|تاريخ=2017|عنوان=Eukaryotic and prokaryotic gene structure|صحيفة=WikiJournal of Medicine|لغة=en|المجلد=4|العدد=1|DOI=10.15347/wjm/2017.002}}</ref> ]]
يستخدم RNA-Seq تسلسل الجيل التالي (NGS) للكشف عن وجود وكمية من الحمض النووي الريبي في عينة بيولوجية في لحظة معينة، وتحليل المتغير الخلوي المستمر.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation|صحيفة=Nucleic Acid Therapeutics|المجلد=22|العدد=4|صفحات=271–4|تاريخ=August 2012|PMID=22830413|PMCID=3426205|DOI=10.1089/nat.2012.0367}}</ref> <ref name="wang2009">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics|صحيفة=Nature Reviews. Genetics|المجلد=10|العدد=1|صفحات=57–63|تاريخ=January 2009|PMID=19015660|PMCID=2949280|DOI=10.1038/nrg2484}}</ref>

على وجه التحديد، يسهل RNA-Seq القدرة على النظر إلى الجينات البديلة المقسمة، والتعديلات بعد النسخ، والانصهار الجيني، والطفرات / SNPs والتغيرات في التعبير الجيني مع مرور الوقت، أو الاختلافات في التعبير الجيني في مجموعات أو علاجات مختلفة.<ref name="maher2009">{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer|صحيفة=Nature|المجلد=458|العدد=7234|صفحات=97–101|تاريخ=March 2009|PMID=19136943|PMCID=2725402|DOI=10.1038/nature07638|bibcode=2009Natur.458...97M}}</ref> بالإضافة إلى نسخ mRNA، يمكن أن ينظر RNA-Seq إلى مجموعات مختلفة من الحمض النووي الريبي (RNA) لتشمل إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA)، والحمض النووي الريبي (RNA) الصغير، مثل miRNA، الحمض الريبي النووي النقال (tRNA)، وتحديد ملامح الريبوسوم.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments|صحيفة=Nature Protocols|المجلد=7|العدد=8|صفحات=1534–50|تاريخ=July 2012|PMID=22836135|PMCID=3535016|DOI=10.1038/nprot.2012.086}}</ref> يمكن أيضًا استخدام RNA-Seq لتحديد حدود exon / intron والتحقق من أو تعديل حدود الجين الموضحة مسبقًا 5 و3. تشمل التطورات الحديثة في RNA-Seq تسلسل خلية وحيدة وتسلسل الأنسجة الثابتة في الموقع.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ|صحيفة=Science|المجلد=343|العدد=6177|صفحات=1360–3|تاريخ=March 2014|PMID=24578530|PMCID=4140943|DOI=10.1126/science.1250212|bibcode=2014Sci...343.1360L}}</ref>

قبل RNA-Seq، أجريت دراسات التعبير الجيني مع المصفوفات الدقيقة القائمة على التهجين. تشمل مشاكل المصفوفات الدقيقة القطع الجينية المتقاطعة، التهميش السيئ للجينات منخفضة الوزن وعالية التعبير، والحاجة إلى معرفة التسلسل المسبق.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=RNA Sequencing and Analysis|صحيفة=Cold Spring Harbor Protocols|المجلد=2015|العدد=11|صفحات=951–69|تاريخ=April 2015|PMID=25870306|PMCID=4863231|DOI=10.1101/pdb.top084970}}</ref> بسبب هذه المشكلات الفنية، انتقلت النصوص إلى الأساليب القائمة على التسلسل. لقد تطورت هذه من تسلسل Sanger في مكتبات Expressed Sequence Tag، إلى الأساليب القائمة على العلامات الكيميائية (على سبيل المثال، التحليل التسلسلي للتعبير الجيني)، وأخيراً إلى التكنولوجيا الحالية، تسلسل الجيل القادم من cDNA (خاصة RNA-Seq).

== الأساليب ==

=== إعداد متسلسل ===
[[ملف:Journal.pcbi.1004393.g002.png|تصغير| نظرة عامة على سير العمل التجريبي RNA-Seq النموذجي.<ref name="ReferenceA">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Informatics for RNA Sequencing: A Web Resource for Analysis on the Cloud|صحيفة=PLoS Computational Biology|المجلد=11|العدد=8|صفحات=e1004393|تاريخ=August 2015|PMID=26248053|PMCID=4527835|DOI=10.1371/journal.pcbi.1004393|bibcode=2015PLSCB..11E4393G}}</ref>]]
الخطوات العامة لإعداد متسلسل DNA (cDNA) التكميلية للتسلسل موضحة أسفل، ولكن غالبًا ما تختلف بين المنصات. <ref name="ReferenceA" /> <ref name="wang2009" /> <ref>{{استشهاد ويب
| مسار = http://rnaseq.uoregon.edu/
| عنوان = RNA-seqlopedia
| موقع = rnaseq.uoregon.edu
| تاريخ الوصول = 2017-02-08
|مسار أرشيف= https://web.archive.org/web/20191230172246/https://rnaseq.uoregon.edu/|تاريخ أرشيف=2019-12-30}}</ref>

# عزل الحمض النووي الريبي (RNA): يتم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) من الأنسجة ويخلط مع (DNase) DNase يقلل من كمية الحمض النووي الجيني. يتم ضبط الكمية المفككة من الحمض النووي الريبي مع هلام والخلاصة التحليل الكهربي لمحتوى الشعيرات الدموية ويستخدم لتعيين عدد سلامة الحمض النووي الريبي للعينة. تؤخذ جودة الحمض النووي الريبي (RNA) والمبلغ الإجمالي لبدء الحمض النووي الريبي (RNA) في الاعتبار أثناء خطوات إعداد وتسلسل وتحليل المكتبة اللاحقة.
# اختيار / نضوب الحمض النووي الريبي: لتحليل إشارات الاهتمام، يمكن إما الاحتفاظ بالحمض النووي الريبي المعزول كما هو، مع ترشيح الحمض النووي الريبي مع ذيول متعددة الأقطاب (3) متعددة (poly (A) لتشمل فقط rRNA، المستخلص من الحمض النووي (rRNA)، و / أو تمت تصفيته من أجل الحمض النووي الريبي (RNA) الذي يربط تسلسلات محددة (جدول اختيار ونضج الحمض النووي الريبي، أسفل). الحمض النووي الريبي مع ذيول 3 '(بولي) الناضجة، والمعالجة، والتابعة لتسلسل الترميز. يتم اختيار (Poly A) عن طريق مزج الحمض النووي الريبي (RNA) مع قلة قليلة من القسيمات (T) المرتبطة تساهميًا بالركيزة، الخرز المغناطيسي عادة.<ref name="morin2008">{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Profiling the HeLa S3 transcriptome using randomly primed cDNA and massively parallel short-read sequencing|صحيفة=BioTechniques|المجلد=45|العدد=1|صفحات=81–94|تاريخ=July 2008|PMID=18611170|DOI=10.2144/000112900|مسار=http://www.bcgsc.ca/about/pubann/biotechniques-publication-2008-44-8| مسار أرشيف = https://web.archive.org/web/20190331204531/http://www.bcgsc.ca/about/pubann/biotechniques-publication-2008-44-8 | تاريخ أرشيف = 31 مارس 2019 }}</ref> <ref name="mortazavi2008">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq|صحيفة=Nature Methods|المجلد=5|العدد=7|صفحات=621–8|تاريخ=July 2008|PMID=18516045|DOI=10.1038/nmeth.1226}}</ref> يتجاهل اختيار (Poly A) الحمض النووي الريبي غير المشفر ويقدم تحيزًا 3 '، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Effect of RNA integrity on uniquely mapped reads in RNA-Seq|صحيفة=BMC Research Notes|المجلد=7|العدد=1|صفحات=753|تاريخ=October 2014|PMID=25339126|PMCID=4213542|DOI=10.1186/1756-0500-7-753}}</ref> والذي يتم تجنبه باستراتيجية نضوب الريبوسوم. تتم إزالة rRNA لأنه يمثل أكثر من 90 ٪ من الحمض النووي الريبي في الخلية، والتي إذا تم الاحتفاظ بها سوف تتخلص من البيانات الأخرى.
# تخليق cDNA: يتم نسخ RNA إلى cDNA لأن الحمض النووي أكثر استقرارًا ويسمح بالتضخيم (عن طريق polymerases الحمض النووي) وتقنية تسلسل الحمض النووي أكثر نضجًا. يؤدي التضخيم اللاحق للنسخ العكسي إلى فقد السبل، والتي يمكن تجنبها بالوسم الكيميائي أو تسلسل جزيء واحد. يتم تنفيذ تجزئة واختيار الحجم لتنقية التسلسلات التي هي الطول المناسب لآلة التسلسل. الحمض النووي الريبيrRNA، cDNA, أو كليهما مجزأ مع الإنزيمات، صوتنه، أو البخاخات. يعمل تجزئة الحمض النووي الريبي على تقليل انحياز 5 'من النسخ العكسي العشوائي وتأثير مواقع الربط التمهيدي، مع الجانب الذي ينتهي به الطرفان 5 و3 إلى الحمض النووي أقل كفاءة. يتبع التجزؤ اختيار الحجم، حيث تتم إزالة تسلسلات صغيرة أو تحديد نطاق ضيق من أطوال التسلسل. بسبب ضياع rRNA الصغيرة مثل miRNAs، يتم تحليلها بشكل مستقل. يمكن فهرسة cDNA لكل تجربة مع الباركود hexamer أو octamer، بحيث يمكن تجميع هذه التجارب في مسار واحد لتسلسل متعدد الإرسال.

{| class="wikitable"
|+ style="text-align: left;" | '''طرق اختيار وانضاب الحمض النووي الريبي''': <ref name="ReferenceA" /> 
! إستراتيجية 
! نوع الحمض النووي rRNA 
! محتوى الحمض النووي rRNA 
! محتوى الحمض النووي rRNA غير المعالج 
! محتوى الحمض النووي الجيني 
! طريقة عزل المحتوى 
|-
| مجموع الحمض النووي rRNA 
| الكل 
| عالي 
| عالي 
| عالي 
| لا شيء 
|-
| اختيار PolyA 
| مرموز 
| منخفض 
| منخفض 
| منخفض 
| تهجين مع [[قليل القسيمات|oligomers]] بولي (dT) 
|-
| نضوب rRNA 
| مرموز، غير مرموز 
| منخفض 
| عالي 
| عالي 
| زالة ال oligomers المكملة ل rRNA  
|-
| الحصول على rRNA 
| مستهدف 
| منخفض 
| متوسط 
| منخفض 
| التهجين مع اجزاء مكملة للتابعات المطلوبة  
|}

=== RNA صغير / غير مرموز لتسلسل RNA ===
عند إجراء تسلسل RNA غير miRNA، يتم تعديل إعداد التسلسل. يتم تحديد الحمض النووي الريبي على أساس نطاق الحجم المطلوب. لأهداف الحمض النووي الريبي الصغيرة، مثل miRNA، يتم عزل الحمض النووي الريبي من خلال اختيار الحجم. يمكن إجراء ذلك باستخدام هلام استبعاد الحجم، من خلال حبات مغناطيسية لاختيار الحجم، أو باستخدام مجموعة تم تطويرها تجاريًا. بمجرد عزلها، تتم إضافة الروابط إلى النهاية 3 'و5' ثم تنقيتها. والخطوة الأخيرة هي الجيل cDNA من خلال النسخ العكسي.

=== تسلسل الحمض النووي الريبي rRNA المباشر ===
[[ملف:RNASeqPics1.jpg|تصغير]]
[[ملف:RNASeqPics2.jpg|تصغير]]
نظرًا لأن تحويل الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي الريبي النووي (cDNA)، فقد ثبت أن عمليات الربط، والتضخيم، والتلاعب بالعينات الأخرى تقدم تحيزات وأدوات أثرية قد تتداخل مع كل من التوصيف الصحيح والتابعات الصحيحة للنصوص الجينية، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Quantitative comparison of EST libraries requires compensation for systematic biases in cDNA generation|صحيفة=BMC Bioinformatics|المجلد=7|العدد=|صفحات=77|تاريخ=February 2006|PMID=16503995|PMCID=1431573|DOI=10.1186/1471-2105-7-77}}</ref> تم استكشاف تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر للجزيء المفرد [13] ، بما في ذلك Helicos (المفلسة)، أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores|صحيفة=Nature Methods|المجلد=15|العدد=3|صفحات=201–206|تاريخ=March 2018|PMID=29334379|DOI=10.1038/nmeth.4577}}</ref> وغيرها. هذه التكنولوجيا تسلسل جزيئات الحمض النووي الريبي مباشرة بطريقة موازية على نطاق واسع.

=== تسلسل RNA أحادي الخلية (scRNA-Seq) ===
الطرق القياسية مثل المصفوفات الدقيقة وتحليل المعيار RNA-Seq يحلل تعبير ال rRNA من مجموعات كبيرة من الخلايا. في مجموعات الخلايا المختلطة، قد تحجب هذه القياسات الفروق الحرجة بين الخلايا الفردية داخل هذه المجموعات.<ref name="Shapiro">"{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science|صحيفة=Nature Reviews. Genetics|المجلد=14|العدد=9|صفحات=618–30|تاريخ=September 2013|PMID=23897237|DOI=10.1038/nrg3542}}"</ref> <ref name="Kolodziejczyk">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=The technology and biology of single-cell RNA sequencing|صحيفة=Molecular Cell|المجلد=58|العدد=4|صفحات=610–20|تاريخ=May 2015|PMID=26000846|DOI=10.1016/j.molcel.2015.04.005}}</ref>

يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-Seq) ملفات تعريف للخلايا الفردية. على الرغم من أنه لا يمكن الحصول على معلومات كاملة عن كل RNA الذي يعبر عن كل خلية، نظرًا للكمية الضئيلة من المواد المتاحة، يمكن التعرف على أنماط التعبير الجيني من خلال تحليلات تجميع الجينات. هذا يمكن أن يكشف عن وجود أنواع خلايا نادرة داخل مجتمع الخلية والتي ربما لم يسبق رؤيتها من قبل. على سبيل المثال، تم تحديد خلايا متخصصة نادرة في الرئة تدعى الخلايا الأيونية الرئوية التي تعبر عن منظم توصيل غشاء التليف الكيسي في 2018 من قبل مجموعتين تؤديان ال rRna ساق على ظهارة مجرى الرئة.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes|صحيفة=Nature|المجلد=560|العدد=7718|صفحات=319–324|تاريخ=August 2018|PMID=30069044|PMCID=6295155|DOI=10.1038/s41586-018-0393-7|bibcode=2018Natur.560..319M}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte|صحيفة=Nature|المجلد=560|العدد=7718|صفحات=377–381|تاريخ=August 2018|PMID=30069046|PMCID=6108322|DOI=10.1038/s41586-018-0394-6|bibcode=2018Natur.560..377P}}</ref>

==== الإجراءات التجريبية ====
[[ملف:RNA-Seq_workflow-5.pdf|يسار|تصغير| خلية عمل تسلسل RNA أحادية الخلية]]
تتضمن بروتوكولات scRNA-Seq الحالية الخطوات التالية: عزل خلية واحدة وRNA، النسخ العكسي (RT)، والتضخيم، وتوليد التسلسل، والتسلسل. طرق مبكرة فصل الخلايا الفردية إلى آبار منفصلة. طرق أكثر حداثة تغلف الخلايا الفردية في قطرات في جهاز ميكروفلويديك، حيث يحدث رد فعل النسخ العكسي، وتحويل الحمض النووي الريبي إلى cDNAكل قطرة تحمل «الباركود» DNA الذي يسمي بشكل فريدcDNA المستمدة من خلية واحدة. بمجرد اكتمال النسخ العكسي، يمكن خلط cDNAمن العديد من الخلايا معًا للتسلسل؛ يتم التعرف على النصوص من خلية معينة بواسطة الرمز الشريطي الفريد.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells|صحيفة=Cell|المجلد=161|العدد=5|صفحات=1187–1201|تاريخ=May 2015|PMID=26000487|PMCID=4441768|DOI=10.1016/j.cell.2015.04.044}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets|صحيفة=Cell|المجلد=161|العدد=5|صفحات=1202–1214|تاريخ=May 2015|PMID=26000488|PMCID=4481139|DOI=10.1016/j.cell.2015.05.002}}</ref>

تشمل تحديات scRNA-Seq الحفاظ على الوفرة النسبية الأولية للـ mRNA في الخلية وتحديد النصوص النادرة.<ref name="Hebenstreit">"{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Methods, Challenges and Potentials of Single Cell RNA-seq|صحيفة=Biology|المجلد=1|العدد=3|صفحات=658–67|تاريخ=November 2012|PMID=24832513|PMCID=4009822|DOI=10.3390/biology1030658}}"</ref> تعتبر خطوة النسخ العكسي أمرًا بالغ الأهمية نظرًا لأن كفاءة رد فعل RT تحدد مقدار تحليل الحمض النووي الريبي للخلية الذي سيتم تحليله في نهاية الأمر بواسطة جهاز التسلسل. قد تؤثر قابلية النسخ العكسي واستراتيجيات التحضير المستخدمة على إنتاج cDNA كامل الطول وتوليد مكتبات منحازة نحو نهاية 3 أو 5 'من الجينات.

في خطوة التضخيم، يتم الآن استخدام PCR أو في النسخ المختبرية (IVT) لتضخيم cDNA واحدة من مزايا الأساليب القائمة على PCR هي القدرة على توليد cDNA كامل الطول. ومع ذلك، قد يتم تضخيم كفاءة PCR مختلفة على تسلسلات معينة على سبيل المثال، محتوى GC وهيكل snapback بشكل كبير، مما ينتج مكتبات ذات تغطية غير متساوية. من ناحية أخرى، في حين أن التسلسلات التي تم إنشاؤها بواسطة IVT يمكنها تجنب تحيز التسلسل الناتج عن PCR، فقد يتم نسخ تسلسلات محددة بطريقة غير فعالة، مما يسبب تسلسل المتسلسل أو توليد تسلسلات غير مكتملة.<ref name="Eberwine">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=The promise of single-cell sequencing|صحيفة=Nature Methods|المجلد=11|العدد=1|صفحات=25–7|تاريخ=January 2014|PMID=24524134|DOI=10.1038/nmeth.2769}}</ref> <ref name="Shapiro" /> تم نشر العديد من بروتوكولات scRNA-Seq: Tang et al. STRT.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell|صحيفة=Nature Methods|المجلد=6|العدد=5|صفحات=377–82|تاريخ=May 2009|PMID=19349980|DOI=10.1038/NMETH.1315}}</ref> STRT ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq|صحيفة=Genome Research|المجلد=21|العدد=7|صفحات=1160–7|تاريخ=July 2011|PMID=21543516|PMCID=3129258|DOI=10.1101/gr.110882.110}}</ref> SMART-seq ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells|صحيفة=Nature Biotechnology|المجلد=30|العدد=8|صفحات=777–82|تاريخ=August 2012|PMID=22820318|PMCID=3467340|DOI=10.1038/nbt.2282}}</ref> CEL-seq ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=CEL-Seq: single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification|صحيفة=Cell Reports|المجلد=2|العدد=3|صفحات=666–73|تاريخ=September 2012|PMID=22939981|DOI=10.1016/j.celrep.2012.08.003}}</ref> RAGE-seq ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes|صحيفة=bioRxiv|سنة=2018|DOI=10.1101/424945}}</ref> ، Quartz-seq.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity|صحيفة=Genome Biology|المجلد=14|العدد=4|صفحات=R31|تاريخ=April 2013|PMID=23594475|PMCID=4054835|DOI=10.1186/gb-2013-14-4-r31}}</ref> و C1-CAGE.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=C1 CAGE detects transcription start sites and enhancer activity at single-cell resolution|صحيفة=Nature Communications|المجلد=10|العدد=1|صفحات=360|تاريخ=January 2019|PMID=30664627|PMCID=6341120|DOI=10.1038/s41467-018-08126-5|bibcode=2019NatCo..10..360K}}</ref> من حيث استراتيجيات النسخ العكسي، وتوليف cDNA والتضخيم، وإمكانية استيعاب الباركود الخاصة بالتسلسل مثل UMIs أو القدرة على معالجة العينات المجمعة.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=How to design a single-cell RNA-sequencing experiment: pitfalls, challenges and perspectives|صحيفة=Briefings in Bioinformatics|المجلد=|العدد=|صفحات=bby007|تاريخ=January 2018|PMID=29394315|DOI=10.1093/bib/bby007}}</ref>

في عام 2017، تم تقديم طريقتين لقياس في وقت واحد مرنا وحيد الخلية وتعبير البروتين من خلال الأجسام المضادة المسمى أليغنوكليوتيد المعروفة باسم REAP-seq ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells|صحيفة=Nature Biotechnology|المجلد=35|العدد=10|صفحات=936–939|تاريخ=October 2017|PMID=28854175|DOI=10.1038/nbt.3973|الأول8=Namit|الأول9=Kelvin Xi|الأول6=Lixia|الأول7=Jerelyn}}</ref> و CITE-seq.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells|صحيفة=Nature Methods|المجلد=14|العدد=9|صفحات=865–868|تاريخ=September 2017|PMID=28759029|PMCID=5669064|DOI=10.1038/nmeth.4380|الأول8=Marlon|الأول5=Brian|الأول6=William|الأول7=Christoph}}</ref>

==== تطبيقات ====
أصبح scRNA-Seq يستخدم على نطاق واسع عبر التخصصات البيولوجية بما في ذلك التنمية، وعلم [[طب الجهاز العصبي|الأعصاب]]، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Simultaneous single-cell profiling of lineages and cell types in the vertebrate brain|صحيفة=Nature Biotechnology|المجلد=36|العدد=5|صفحات=442–450|تاريخ=June 2018|PMID=29608178|PMCID=5938111|DOI=10.1038/nbt.4103}}</ref> [[علم الأورام]]، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience|صحيفة=Annals of Oncology|المجلد=20|العدد=1|صفحات=27–33|تاريخ=January 2009|PMID=18695026|DOI=10.1093/annonc/mdn544}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Single-Cell Transcriptomic Analysis of Tumor Heterogeneity|لغة=English|صحيفة=Trends in Cancer|المجلد=4|العدد=4|صفحات=264–268|تاريخ=April 2018|PMID=29606308|PMCID=5993208|DOI=10.1016/j.trecan.2018.02.003|مسار=https://www.cell.com/trends/cancer/abstract/S2405-8033(18)30038-4| مسار أرشيف = https://web.archive.org/web/20200511190155/https://www.cell.com/trends/cancer/fulltext/S2405-8033(18)30038-4 | تاريخ أرشيف = 11 مايو 2020 }}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=A Cancer Cell Program Promotes T Cell Exclusion and Resistance to Checkpoint Blockade|لغة=English|صحيفة=Cell|المجلد=175|العدد=4|صفحات=984–997.e24|تاريخ=November 2018|PMID=30388455|PMCID=6410377|DOI=10.1016/j.cell.2018.09.006|مسار=https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(18)31178-4| مسار أرشيف = https://web.archive.org/web/20200511190147/https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)31178-4 | تاريخ أرشيف = 11 مايو 2020 }}</ref> [[مرض مناعي ذاتي|مرض المناعة الذاتية]]، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Single-cell RNA-seq of rheumatoid arthritis synovial tissue using low-cost microfluidic instrumentation|صحيفة=Nature Communications|المجلد=9|العدد=1|صفحات=791|تاريخ=February 2018|PMID=29476078|PMCID=5824814|DOI=10.1038/s41467-017-02659-x|bibcode=2018NatCo...9..791S}}</ref> [[أمراض معدية (اختصاص طبي)|والأمراض المعدية]].<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Pathogen Cell-to-Cell Variability Drives Heterogeneity in Host Immune Responses|صحيفة=Cell|المجلد=162|العدد=6|صفحات=1309–21|تاريخ=September 2015|PMID=26343579|PMCID=4578813|DOI=10.1016/j.cell.2015.08.027}}</ref>

قدمت scRNA-Seq نظرة ثاقبة كبيرة في تطور الأجنة والكائنات الحية، بما في ذلك دودة [[ربداء رشيقة|Caenorhabditis elegans]] ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism|صحيفة=Science|المجلد=357|العدد=6352|صفحات=661–667|تاريخ=August 2017|PMID=28818938|PMCID=5894354|DOI=10.1126/science.aam8940|bibcode=2017Sci...357..661C}}</ref> والمستوصف الشمسي التجديدي المتوسطي ''.'' <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Cell type atlas and lineage tree of a whole complex animal by single-cell transcriptomics|صحيفة=Science|المجلد=360|العدد=6391|صفحات=eaaq1723|تاريخ=May 2018|PMID=29674432|DOI=10.1126/science.aaq1723|مسار=https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=53439| مسار أرشيف = https://web.archive.org/web/20200511173534/https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=53439 | تاريخ أرشيف = 11 مايو 2020 }}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Schmidtea mediterranea|صحيفة=Science|المجلد=360|العدد=6391|صفحات=eaaq1736|تاريخ=May 2018|PMID=29674431|PMCID=6563842|DOI=10.1126/science.aaq1736}}</ref> كانت أول الحيوانات الفقارية التي تم تعيينها بهذه الطريقة هي [[دانيو مخطط|الزرد]] <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Single-cell mapping of gene expression landscapes and lineage in the zebrafish embryo|صحيفة=Science|المجلد=360|العدد=6392|صفحات=981–987|تاريخ=June 2018|PMID=29700229|PMCID=6083445|DOI=10.1126/science.aar4362|bibcode=2018Sci...360..981W}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Single-cell reconstruction of developmental trajectories during zebrafish embryogenesis|صحيفة=Science|المجلد=360|العدد=6392|صفحات=eaar3131|تاريخ=June 2018|PMID=29700225|PMCID=6247916|DOI=10.1126/science.aar3131}}</ref> و ''[[قيطم إفريقي|Xenopus laevis]]''.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution|صحيفة=Science|المجلد=360|العدد=6392|صفحات=eaar5780|تاريخ=June 2018|PMID=29700227|PMCID=6038144|DOI=10.1126/science.aar5780}}</ref> في كل حالة، تمت دراسة مراحل متعددة من الجنين، مما يسمح برسم عملية التنمية بأكملها على أساس كل خلية على حدة. <ref name="ReferenceA" /> [[ساينس|لقد]] أدرك [[ساينس|العلم أن]] هذه التطورات هي " [[اختراق العام]] 2018 [[اختراق العام|"]].<ref>{{استشهاد ويب
| مسار = https://vis.sciencemag.org/breakthrough2018/finalists/
| عنوان = Science's 2018 Breakthrough of the Year: tracking development cell by cell
| موقع = Science Magazine
| ناشر = American Association for the Advancement of Science
| الأخير = You
| الأول = Jia
|مسار أرشيف= https://web.archive.org/web/20191206221636/https://vis.sciencemag.org/breakthrough2018/finalists/|تاريخ أرشيف=2019-12-06}}</ref>

=== الاعتبارات التجريبية ===
يتم مراعاة مجموعة متنوعة من [[وسيط (رياضيات)|المعلمات]] عند تصميم وإجراء تجارب RNA-Seq:

* نوعية الأنسجة: يختلف التعبير الجيني داخل الأنسجة وفيما بينها، ويقيس RNA-Seq هذا المزيج من أنواع الخلايا. هذا قد يجعل من الصعب عزل الآلية البيولوجية للاهتمام. يمكن استخدام تسلسل خلية واحدة لدراسة كل خلية على حدة، وتخفيف هذه المشكلة.
* الاعتماد على الوقت: يتغير تعبير الجينات بمرور الوقت، ولا يأخذ RNA-Seq سوى لقطة. يمكن إجراء تجارب الدورة الزمنية لمراقبة التغييرات في النص الجيني.
* التغطية (المعروف أيضًا باسم العمق): يحتوي الحمض النووي الريبي على نفس الطفرات التي لوحظت في الحمض النووي، ويتطلب الكشف تغطية أعمق. مع تغطية عالية بما فيه الكفاية، يمكن استخدام RNA-Seq لتقدير التعبير عن كل أليل. قد يوفر هذا نظرة ثاقبة الظواهر مثل التأثيرات أو التأثيرات التنظيمية. يمكن استقراء عمق التسلسل المطلوب لتطبيقات محددة من تجربة تجريبية.<ref name="li2008">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Determination of tag density required for digital transcriptome analysis: application to an androgen-sensitive prostate cancer model|صحيفة=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America|المجلد=105|العدد=51|صفحات=20179–84|تاريخ=December 2008|PMID=19088194|PMCID=2603435|DOI=10.1073/pnas.0807121105|bibcode=2008PNAS..10520179L}}</ref>
* قطع لتوليد البيانات (تُعرف أيضًا باسم التباين التقني): يمكن أن تؤدي الكواشف (على سبيل المثال، مجموعة إعداد التسلسل) والموظفين المعنيين ونوع جهاز التسلسل على سبيل المثال، Illumina وPacific Biosciences إلى آثار فنية قد يساء تفسيرها على أنها نتائج ذات معنى. كما هو الحال مع أي تجربة علمية، من الحكمة إجراء RNA-Seq في بيئة جيدة التحكم. إذا لم يكن ذلك ممكنًا أو كانت الدراسة عبارة عن تحليل تلوي، فإن الحل الآخر هو اكتشاف القطع الفنية عن طريق استنتاج المتغيرات الكامنة (عادة تحليل المكون الرئيسي أو تحليل العوامل) والتصحيح لاحقًا لهذه المتغيرات.<ref name="Using probabilistic estimation of e">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Using probabilistic estimation of expression residuals (PEER) to obtain increased power and interpretability of gene expression analyses|صحيفة=Nature Protocols|المجلد=7|العدد=3|صفحات=500–7|تاريخ=February 2012|PMID=22343431|PMCID=3398141|DOI=10.1038/nprot.2011.457}}</ref>
* إدارة البيانات: عادة ما تكون تجربة RNA-Seq في البشر في حدود [[جيجابايت|1 غيغابايت]].<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Reference-based compression of short-read sequences using path encoding|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=31|العدد=12|صفحات=1920–8|تاريخ=June 2015|PMID=25649622|PMCID=4481695|DOI=10.1093/bioinformatics/btv071}}</ref> هذا الحجم الكبير من البيانات يمكن أن يطرح مشاكل التخزين. أحد الحلول هو ضغط البيانات باستخدام مخططات حسابية متعددة الأغراض (على سبيل المثال، gzip أو مخططات خاصة بالجينوم. هذا الأخير يمكن أن يكون على أساس تسلسل مرجعي أو دي نوفو. الحل الآخر هو إجراء تجارب ميكروأري، والتي قد تكون كافية لإجراء الدراسات التي تعتمد على الفرضيات أو تكرارها على عكس البحوث الاستكشافية.

== التحليل ==
[[ملف:RNASeqWorkflow2016.png|تصغير| رسم تخطيطي يوضح تحليلات RNA-Seq الموصوفة في هذا القسم]]

=== التجمع النسخي ===
يتم استخدام طريقتين لتعيين تسلسلات القراءة الأولية للميزات الجينومية (أي تجميع النص الجيني):

* دي نوفو: هذا النهج لا يحتاج إلى جينوم مرجعي لإعادة بناء النص، ويستخدم عادة إذا كان الجينوم غير معروف، غير مكتمل، أو تم تغييره بشكل كبير مقارنة بالمرجع.<ref name="ReferenceB">{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome|صحيفة=Nature Biotechnology|المجلد=29|العدد=7|صفحات=644–52|تاريخ=May 2011|PMID=21572440|PMCID=3571712|DOI=10.1038/nbt.1883}}</ref> تتضمن التحديات عند استخدام عمليات القراءة القصيرة لتجميع de novo 1)) تحديد القراءات التي يجب ضمها معًا في تسلسلات متجاورة contigs)، 2) متانة أخطاء التسلسل وغيرها من الأعمال الفنية، و3 الكفاءة الحسابية. تم نقل الخوارزمية الأساسية المستخدمة لتجميع de novo من الرسوم البيانية المتداخلة، والتي تحدد جميع التداخلات بين الزوجين إلى القراءات، إلى الرسوم البيانية لـ Bru Brunn، والتي تقسم القراءة إلى تسلسلات طولها k وتنهار كل k-mers في جدول تجزئة.<ref>{{استشهاد ويب
| مسار = https://www.illumina.com/Documents/products/technotes/technote_denovo_assembly_ecoli.pdf
| عنوان = De Novo Assembly Using Illumina Reads
| تاريخ الوصول = 22 October 2016
| مسار أرشيف = https://web.archive.org/web/20190430144431/https://www.illumina.com/Documents/products/technotes/technote_denovo_assembly_ecoli.pdf | تاريخ أرشيف = 30 أبريل 2019 }}</ref> تم استخدام الرسوم البيانية المتداخلة مع تسلسل Sanger، لكن لا يتم القياس جيدًا إلى ملايين القراءات التي تم إنشاؤها باستخدام RNA-Seq. أمثلة على المجمعات التي تستخدم الرسوم البيانية دي Bruijn هي Velvet ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs|صحيفة=Genome Research|المجلد=18|العدد=5|صفحات=821–9|تاريخ=May 2008|PMID=18349386|PMCID=2336801|DOI=10.1101/gr.074492.107}}</ref> Trinity ، Oases ، <ref>[https://www.ebi.ac.uk/~zerbino/oases/ Oases: a transcriptome assembler for very short reads] {{Webarchive|url=https://web.archive.org/web/20181129132720/https://www.ebi.ac.uk/~zerbino/oases/ |date=29 نوفمبر 2018}}</ref> و Bridger.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Bridger: a new framework for de novo transcriptome assembly using RNA-seq data|صحيفة=Genome Biology|المجلد=16|العدد=1|صفحات=30|تاريخ=February 2015|PMID=25723335|PMCID=4342890|DOI=10.1186/s13059-015-0596-2}}</ref> يمكن للنهاية المزدوجة وتسلسل القراءة الطويلة من نفس العينة أن يخففا من العجز في تسلسل القراءة القصيرة من خلال العمل كقالب أو هيكل عظمي. تشتمل مقاييس تقييم جودة مجموعة de novo على متوسط طول contig وعدد contigs و N50.<ref name="ReferenceC">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Evaluation of de novo transcriptome assemblies from RNA-Seq data|صحيفة=Genome Biology|المجلد=15|العدد=12|صفحات=553|تاريخ=December 2014|PMID=25608678|PMCID=4298084|DOI=10.1186/s13059-014-0553-5}}</ref>

[[ملف:RNA-Seq-alignment.png|تصغير| خرائط RNA-Seq للقراءات القصيرة في تقاطعات exon-exon. يتم ترتيب mRNT النهائي ، والذي يفتقد أجزاء intronic من قبل pre-mRNA.]]

* دليل الجينوم: تعتمد هذه الطريقة على نفس الأساليب المستخدمة لمحاذاة الحمض النووي، مع التعقيد الإضافي المتمثل في محاذاة القراءات التي تغطي أجزاء غير مستمرة من الجينوم المرجعي.<ref name="2012 STAR aligner">{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=29|العدد=1|صفحات=15–21|تاريخ=January 2013|PMID=23104886|PMCID=3530905|DOI=10.1093/bioinformatics/bts635}}</ref> هذه القراءات غير المستمرة هي نتيجة لتسلسل النصوص المقسمة (انظر الشكل). عادة، تحتوي خوارزميات المحاذاة على خطوتين: 1) محاذاة أجزاء قصيرة من القراءة (أي، بداية الجينوم)، و 2) استخدام [[برمجة ديناميكية|البرمجة الديناميكية]] لإيجاد محاذاة مثالية، وأحيانًا بالاقتران مع تعليقات توضيحية معروفة. تشمل أدوات البرمجيات التي تستخدم المحاذاة الموجهة للجينوم Bowtie ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome|صحيفة=Genome Biology|المجلد=10|العدد=3|صفحات=R25|تاريخ=2009|PMID=19261174|PMCID=2690996|DOI=10.1186/gb-2009-10-3-r25}}</ref> TopHat (الذي يبني على نتائج BowTie لمحاذاة الوصلات الفاصلة)، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=25|العدد=9|صفحات=1105–11|تاريخ=May 2009|PMID=19289445|PMCID=2672628|DOI=10.1093/bioinformatics/btp120}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks|صحيفة=Nature Protocols|المجلد=7|العدد=3|صفحات=562–78|تاريخ=March 2012|PMID=22383036|PMCID=3334321|DOI=10.1038/nprot.2012.016}}</ref> Subread ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote|صحيفة=Nucleic Acids Research|المجلد=41|العدد=10|صفحات=e108|تاريخ=May 2013|PMID=23558742|PMCID=3664803|DOI=10.1093/nar/gkt214}}</ref> STAR ، HISAT2 ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements|صحيفة=Nature Methods|المجلد=12|العدد=4|صفحات=357–60|تاريخ=April 2015|PMID=25751142|PMCID=4655817|DOI=10.1038/nmeth.3317}}</ref> Sailfish ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms|مسار=https://archive.org/details/sim_nature-biotechnology_2014-05_32_5/page/462|صحيفة=Nature Biotechnology|المجلد=32|العدد=5|صفحات=462–4|تاريخ=May 2014|PMID=24752080|PMCID=4077321|DOI=10.1038/nbt.2862|arxiv=1308.3700}}</ref> كاليستو، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification|صحيفة=Nature Biotechnology|المجلد=34|العدد=5|صفحات=525–7|تاريخ=May 2016|PMID=27043002|DOI=10.1038/nbt.3519}}</ref> و GMAP.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=21|العدد=9|صفحات=1859–75|تاريخ=May 2005|PMID=15728110|DOI=10.1093/bioinformatics/bti310}}</ref> يمكن قياس جودة التجميع الموجه للجينوم بمقاييس التجميع 1) de novo (على سبيل المثال، N50) و 2) مقارنات بالتسلسلات المعروفة، تقاطع الوصلات، الجينوم، والبروتين باستخدام [[دقة ومراجعة|الدقة ، الاستعادة]]، أو توليفها (على سبيل المثال، النتيجة F1). <ref name="ReferenceC" /> بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تقييم ''السيليكو'' باستخدام قراءات محاكية.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Simulation-based comprehensive benchmarking of RNA-seq aligners|لغة=En|صحيفة=Nature Methods|المجلد=14|العدد=2|صفحات=135–139|تاريخ=February 2017|PMID=27941783|PMCID=5792058|DOI=10.1038/nmeth.4106}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Systematic evaluation of spliced alignment programs for RNA-seq data|لغة=En|صحيفة=Nature Methods|المجلد=10|العدد=12|صفحات=1185–91|تاريخ=December 2013|PMID=24185836|PMCID=4018468|DOI=10.1038/nmeth.2722}}</ref>

ملاحظة على جودة التجميع: الإجماع الحالي هو أن 1) يمكن أن تختلف جودة التجميع تبعًا للمقياس المستخدم، 2) التجميعات التي سجلت جيدًا في أحد الأنواع لا تؤدي بالضرورة أداءً جيدًا في الأنواع الأخرى، و3) قد يؤدي الجمع بين الطرق المختلفة إلى كن الأكثر موثوقية.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Comparative study of de novo assembly and genome-guided assembly strategies for transcriptome reconstruction based on RNA-Seq|صحيفة=Science China Life Sciences|المجلد=56|العدد=2|صفحات=143–55|تاريخ=February 2013|PMID=23393030|DOI=10.1007/s11427-013-4442-z}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species|صحيفة=GigaScience|المجلد=2|العدد=1|صفحات=10|تاريخ=July 2013|PMID=23870653|PMCID=3844414|DOI=10.1186/2047-217X-2-10|arxiv=1301.5406|bibcode=2013arXiv1301.5406B}}</ref>

=== التعبير الجيني الكمي ===
يتم التعبير عن التعبير الكمي لدراسة التغيرات الخلوية استجابةً للمنبهات الخارجية، الاختلافات بين الحالات الصحية والمرضية، وغيرها من الأسئلة البحثية. غالبًا ما يستخدم تعبير الجين كبديل لوفرة البروتين، لكن غالبًا ما تكون هذه العناصر غير متكافئة بسبب أحداث ما بعد النسخ مثل تدخل الحمض النووي الريبي وانحلال بوساطة الهراء.<ref name="greenbaum2003">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale|صحيفة=Genome Biology|المجلد=4|العدد=9|صفحات=117|سنة=2003|PMID=12952525|PMCID=193646|DOI=10.1186/gb-2003-4-9-117}}</ref>

يتم تحديد التعبير عن طريق حساب عدد القراءات التي تم تعيينها لكل موقع في خطوة التجميع transcriptome. يمكن قياس التعبير عن الإكسونات أو الجينات باستخدام contigs أو التعليقات التوضيحية المرجعية. <ref name="ReferenceA" /> تم التحقق من صحة تعدادات RNA-Seq التي تمت ملاحظتها بقوة ضد التقنيات القديمة، بما في ذلك المصفوفات الدقيقة التعبير و[[تفاعل البوليمراز المتسلسل بالزمن الحقيقي|qPCR]] . <ref name="li2008" /> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=A comparative study of techniques for differential expression analysis on RNA-Seq data|صحيفة=PLOS ONE|المجلد=9|العدد=8|صفحات=e103207|تاريخ=August 2014|PMID=25119138|PMCID=4132098|DOI=10.1371/journal.pone.0103207|bibcode=2014PLoSO...9j3207Z}}</ref> من الأمثلة على الأدوات التي تحدد التعدادات HTSeq ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=31|العدد=2|صفحات=166–9|تاريخ=January 2015|PMID=25260700|PMCID=4287950|DOI=10.1093/bioinformatics/btu638}}</ref> FeatureCounts ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=30|العدد=7|صفحات=923–30|تاريخ=April 2014|PMID=24227677|DOI=10.1093/bioinformatics/btt656|arxiv=1305.3347}}</ref> Rcount ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Rcount: simple and flexible RNA-Seq read counting|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=31|العدد=3|صفحات=436–7|تاريخ=February 2015|PMID=25322836|DOI=10.1093/bioinformatics/btu680}}</ref> maxcounts ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Reducing bias in RNA sequencing data: a novel approach to compute counts|صحيفة=BMC Bioinformatics|المجلد=15 Suppl 1|العدد=Suppl 1|صفحات=S7|تاريخ=2014|PMID=24564404|PMCID=4016203|DOI=10.1186/1471-2105-15-s1-s7}}</ref> FIXSEQ ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Universal count correction for high-throughput sequencing|صحيفة=PLoS Computational Biology|المجلد=10|العدد=3|صفحات=e1003494|تاريخ=March 2014|PMID=24603409|PMCID=3945112|DOI=10.1371/journal.pcbi.1003494|bibcode=2014PLSCB..10E3494H}}</ref> و Cuffquant. ثم يتم تحويل عدد القراءة إلى مقاييس مناسبة لاختبار الفرضيات والانحدارات والتحليلات الأخرى. المعلمات لهذا التحويل هي:

* العمق / التغطية المتسلسلة: على الرغم من أن العمق محدد مسبقًا عند إجراء تجارب RNA-Seq متعددة، إلا أنه سيظل متباينًا على نطاق واسع بين التجارب.<ref name="ReferenceD">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data|صحيفة=Genome Biology|المجلد=11|العدد=3|صفحات=R25|تاريخ=2010|PMID=20196867|PMCID=2864565|DOI=10.1186/gb-2010-11-3-r25}}</ref> لذلك، عادةً ما يتم تطبيع إجمالي عدد القراءات التي تم إنشاؤها في تجربة واحدة عن طريق تحويل التعدادات إلى أجزاء أو قراءات أو تعدادات لكل مليون قراءة معيّنة FPM أو RPM أو CPM يشار إلى عمق التسلسل أحيانًا بحجم المكتبة، وعدد جزيئات cDNA الوسيطة في التجربة.
* طول الجينات: سيكون للجينات الأطول شظايا / قراءات / تعدادات أكثر من الجينات الأقصر إذا كان تعبير النص الجيني هو نفسه. يتم ضبط هذا عن طريق تقسيم FPM على طول الجين، مما يؤدي إلى شظايا متري لكل كيلوبايت من النص لكل مليون قراءة المعينة (FPKM).<ref name="trapnell2010">{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation|مسار=https://archive.org/details/sim_nature-biotechnology_2010-05_28_5/page/511|صحيفة=Nature Biotechnology|المجلد=28|العدد=5|صفحات=511–5|تاريخ=May 2010|PMID=20436464|PMCID=3146043|DOI=10.1038/nbt.1621|مؤلف9-وصلة=Lior Pachter}}</ref> عند النظر إلى مجموعات من الجينات عبر العينات، يتم تحويل FPKM إلى نصوص لكل مليون (TPM) عن طريق تقسيم كل FPKM على مجموع FPKMs داخل عينة.<ref>{{استشهاد ويب
| مسار = https://haroldpimentel.wordpress.com/2014/05/08/what-the-fpkm-a-review-rna-seq-expression-units/
| عنوان = What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units
| تاريخ = 8 May 2014
| موقع = The farrago
| تاريخ الوصول = 28 March 2018
|مسار أرشيف= https://web.archive.org/web/20191230122243/https://haroldpimentel.wordpress.com/2014/05/08/what-the-fpkm-a-review-rna-seq-expression-units/|تاريخ أرشيف=2019-12-30}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples|صحيفة=Theory in Biosciences = Theorie in den Biowissenschaften|المجلد=131|العدد=4|صفحات=281–5|تاريخ=December 2012|PMID=22872506|DOI=10.1007/s12064-012-0162-3}}</ref>
* مجموع عينة الحمض النووي الريبي: لأن نفس كمية الحمض النووي الريبي المستخرجة من كل عينة، فإن العينات ذات الحمض النووي الريبي الإجمالي أكثر سيكون لها عدد أقل من الحمض النووي الريبي لكل جين. يبدو أن هذه الجينات قد قللت من التعبير، مما أدى إلى إيجابيات كاذبة في التحليلات النهائية.
* تباين تعبير كل جين: يتم تصميمه ليتم حسابه على خطأ أخذ العينات (مهم للجينات ذات التعداد المنخفض للقراءة)، ويزيد الطاقة، ويقلل من الإيجابيات الخاطئة. يمكن تقدير التباين كتوزيع طبيعي، أو بواسون، أو سلبي ذو حدين <ref name="voom: Precision weights unlock line">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts|صحيفة=Genome Biology|المجلد=15|العدد=2|صفحات=R29|تاريخ=February 2014|PMID=24485249|PMCID=4053721|DOI=10.1186/gb-2014-15-2-r29}}</ref> <ref name="Differential expression analysis fo">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Differential expression analysis for sequence count data|صحيفة=Genome Biology|المجلد=11|العدد=10|صفحات=R106|تاريخ=2010|PMID=20979621|PMCID=3218662|DOI=10.1186/gb-2010-11-10-r106}}</ref> <ref name="edgeR: a Bioconductor package for d">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=26|العدد=1|صفحات=139–40|تاريخ=January 2010|PMID=19910308|PMCID=2796818|DOI=10.1093/bioinformatics/btp616}}</ref> وغالبًا ما يتحلل إلى تباين تقني وبيولوجي.

==== الكم المطلق ====
الكم المطلق للتعبير الجيني غير ممكن في معظم تجارب RNA-Seq، والتي تقيس التعبير بالنسبة لجميع النصوص الجينية. من الممكن عن طريق إجراء RNA-Seq مع spike-ins، عينات من RNA بتركيزات معروفة. بعد التسلسل، يتم استخدام التعدادات المقروءة لتسلسلات الزيادة في تحديد العلاقة بين تعدادات القراءة لكل جين والكميات المطلقة من الأجزاء البيولوجية. <ref name="mortazavi2008" /> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Quantitative analysis of fission yeast transcriptomes and proteomes in proliferating and quiescent cells|صحيفة=Cell|المجلد=151|العدد=3|صفحات=671–83|تاريخ=October 2012|PMID=23101633|PMCID=3482660|DOI=10.1016/j.cell.2012.09.019}}</ref> في أحد الأمثلة، تم استخدام هذه التقنية في أجنة Xenopus المدارية لتحديد حركية النسخ.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development|صحيفة=Cell Reports|المجلد=14|العدد=3|صفحات=632–647|تاريخ=January 2016|PMID=26774488|PMCID=4731879|DOI=10.1016/j.celrep.2015.12.050}}</ref>

=== التعبير (النسخ) التفاضلي ===
إن الاستخدام البسيط والأقوى في كثير من الأحيان لـ RNA-Seq هو إيجاد اختلافات في التعبير الجيني بين شرطين أو أكثر (على سبيل المثال، المعالجة مقابل غير المعالجة)؛ وتسمى هذه العملية التعبير التفاضلي. يشار إلى المخرجات بشكل متكرر على أنها جينات معبر عنها تفاضليًا (DEGs) ويمكن أن يتم تنظيم هذه الجينات إما إلى أعلى أو أسفل (أي، أعلى أو أقل في حالة الاهتمام). هناك العديد من الأدوات التي تؤدي تعبيرًا تفاضليًا. يتم تشغيل معظمها في [[آر (لغة برمجة)|R]] أو [[بايثون (توضيح)|Python]] أو سطر أوامر [[يونكس|Unix]] . الأدوات الشائعة الاستخدام تشمل DESeq ، <ref name="Differential expression analysis fo" /> edgeR ، <ref name="edgeR: a Bioconductor package for d" /> و voom + limma ، <ref name="voom: Precision weights unlock line" /> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies|صحيفة=Nucleic Acids Research|المجلد=43|العدد=7|صفحات=e47|تاريخ=April 2015|PMID=25605792|PMCID=4402510|DOI=10.1093/nar/gkv007}}</ref> وكلها متوفرة من خلال موصل R / Bioconductor.<ref>{{استشهاد ويب
| مسار = http://www.bioconductor.org
| عنوان = Bioconductor - Open source software for bioinformatics
|مسار أرشيف= https://web.archive.org/web/20191229040421/http://www.bioconductor.org/|تاريخ أرشيف=2019-12-29}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor|صحيفة=Nature Methods|المجلد=12|العدد=2|صفحات=115–21|تاريخ=February 2015|PMID=25633503|PMCID=4509590|DOI=10.1038/nmeth.3252}}</ref> هذه هي الاعتبارات الشائعة عند تنفيذ التعبير التفاضلي:

* ''المدخلات:'' تشمل مدخلات التعبير التفاضلي (1) مصفوفة تعبير RNA-Seq (جينات M X × عينات) و (2) مصفوفة تصميم تحتوي على ظروف تجريبية لعينات N. تحتوي أبسط مصفوفة التصميم على عمود واحد ، يقابل التسميات للحالة التي يجري اختبارها. يمكن أن تشمل المتغيرات الأخرى (يشار إليها أيضًا بعوامل أو ميزات أو تسميات أو معلمات) تأثيرات الدُفعات والمصنوعات المعروفة وأي بيانات وصفية قد تربك أو تتوسط في التعبير الجيني. بالإضافة إلى المتغيرات المشتركة المعروفة ، يمكن أيضًا تقدير المتغيرات المشتركة غير المعروفة من خلال أساليب [[تعلم غير مراقب|التعلم الآلي غير الخاضعة للإشراف]] بما في ذلك تحليلات [[تحليل العنصر الرئيسي|المكون الرئيسي]] والمتغير البديل <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis|صحيفة=PLoS Genetics|المجلد=3|العدد=9|صفحات=1724–35|تاريخ=September 2007|PMID=17907809|PMCID=1994707|DOI=10.1371/journal.pgen.0030161}}</ref> و PEER.<ref name="Using probabilistic estimation of e" /> غالبًا ما تستخدم التحليلات المتغيرة المخفية لبيانات RNA-Seq الخاصة بالأنسجة البشرية ، والتي تحتوي عادةً على قطع أثرية إضافية لم يتم التقاطها في البيانات الوصفية (على ''سبيل المثال'' ، الوقت الإقفاري ، الاستعانة بمؤسسات متعددة ، السمات السريرية الأساسية ، جمع البيانات عبر العديد من السنوات مع العديد من الموظفين).
* ''الطرق:'' تستخدم معظم الأدوات [[إحصاء لا معلمي|إحصائيات]] [[تحليل الانحدار|الانحدار]] أو [[إحصاء لا معلمي|غير البارامترية]] لتحديد الجينات التي يتم التعبير عنها تفاضليًا ، وتكون إما قائمة على العد (DESeq2 ، limma ، edgeR) أو قائمة على التجميع (عن طريق القياس الكمي بدون محاذاة ، أو الكلب ، <ref name="مولد تلقائيا1">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq|صحيفة=Nature Biotechnology|المجلد=31|العدد=1|صفحات=46–53|تاريخ=January 2013|PMID=23222703|PMCID=3869392|DOI=10.1038/nbt.2450|مسار=https://authors.library.caltech.edu/74743/1/nihms439296.pdf| مسار أرشيف = https://web.archive.org/web/20200511172749/https://authors.library.caltech.edu/74743/1/nihms439296.pdf | تاريخ أرشيف = 11 مايو 2020 }}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Differential analysis of RNA-seq incorporating quantification uncertainty|صحيفة=Nature Methods|المجلد=14|العدد=7|صفحات=687–690|تاريخ=July 2017|PMID=28581496|DOI=10.1038/nmeth.4324}}</ref> Cuffdiff ، <ref name="مولد تلقائيا1" /> Ballgown <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Ballgown bridges the gap between transcriptome assembly and expression analysis|صحيفة=Nature Biotechnology|المجلد=33|العدد=3|صفحات=243–6|تاريخ=March 2015|PMID=25748911|PMCID=4792117|DOI=10.1038/nbt.3172}}</ref>).<ref name="Gaining comprehensive biological in">{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis|صحيفة=Nature Communications|المجلد=8|العدد=1|صفحات=59|تاريخ=July 2017|PMID=28680106|PMCID=5498581|DOI=10.1038/s41467-017-00050-4|bibcode=2017NatCo...8...59S}}</ref> بعد الانحدار ، تستخدم معظم الأدوات إما معدل الخطأ العائلي (FWER) أو تعديلات قيمة الاكتشاف الخاطئ (FDR) لمراعاة الفرضيات المتعددة (في الدراسات البشرية ، ~ 20000 من جينات ترميز البروتين أو ~ 50000 نموذج حيوي).
* المخرجات: يتكون المخرج النموذجي من صفوف تتوافق مع عدد الجينات وثلاثة أعمدة على الأقل، يتغير كل سجل من الجينات (تحويل سجل لنسبة التعبير في الظروف بين، مقياس حجم التأثير)، قيمة p، وp القيمة تعديلها لمقارنات متعددة. يتم تعريف الجينات على أنها ذات معنى من الناحية البيولوجية إذا نجحت في تحديد حجم التأثير (تغيير طية السجل) والأهمية الإحصائية. يجب تحديد هذه القطع بشكل مسبق بشكل مسبق، ولكن طبيعة تجارب RNA-Seq غالبًا ما تكون استكشافية، لذا يصعب التنبؤ بأحجام التأثير والقطع ذات الصلة في وقت مبكر.
* مطبات: سبب وجود هذه الأساليب المعقدة هو تجنب عدد لا يحصى من المزالق التي يمكن أن تؤدي إلى أخطاء إحصائية وتفسيرات مضللة. المطبات تشمل زيادة معدلات إيجابية كاذبة (بسبب المقارنات المتعددة)، والتحف إعداد العينات، وعدم تجانس العينة (مثل الخلفيات الوراثية المختلطة)، وعينات مترابطة للغاية، في عداد المفقودين للتصاميم التجريبية متعددة المستويات، والتصميم التجريبي الفقراء. أحد الأخطاء البارزة هو عرض النتائج في Microsoft Excel.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Gene name errors are widespread in the scientific literature|صحيفة=Genome Biology|المجلد=17|العدد=1|صفحات=177|تاريخ=August 2016|PMID=27552985|PMCID=4994289|DOI=10.1186/s13059-016-1044-7}}</ref> على الرغم من أنه مناسب، يقوم Excel تلقائيًا بتحويل بعض أسماء الجينات SEPT1 وDEC1 وMARCH2 إلى تواريخ أو أرقام الفاصلة العائمة.
* اختيار الأدوات والقياس: هناك العديد من الجهود التي تقارن نتائج هذه الأدوات، حيث تميل DESeq2 إلى التفوق بشكل معتدل على الطرق الأخرى.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=A comparison of methods for differential expression analysis of RNA-seq data|صحيفة=BMC Bioinformatics|المجلد=14|صفحات=91|تاريخ=March 2013|PMID=23497356|PMCID=3608160|DOI=10.1186/1471-2105-14-91}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=RNA-Seq gene profiling--a systematic empirical comparison|صحيفة=PLOS ONE|المجلد=9|العدد=9|صفحات=e107026|تاريخ=30 September 2014|PMID=25268973|PMCID=4182317|DOI=10.1371/journal.pone.0107026|bibcode=2014PLoSO...9j7026F}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies|صحيفة=Briefings in Bioinformatics|المجلد=16|العدد=1|صفحات=59–70|تاريخ=January 2015|PMID=24300110|PMCID=4293378|DOI=10.1093/bib/bbt086}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Comprehensive evaluation of differential gene expression analysis methods for RNA-seq data|صحيفة=Genome Biology|المجلد=14|العدد=9|صفحات=R95|تاريخ=2013|PMID=24020486|PMCID=4054597|DOI=10.1186/gb-2013-14-9-r95}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=A survey of best practices for RNA-seq data analysis|صحيفة=Genome Biology|المجلد=17|العدد=1|صفحات=13|تاريخ=January 2016|PMID=26813401|PMCID=4728800|DOI=10.1186/s13059-016-0881-8}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool|صحيفة=PLOS ONE|المجلد=12|العدد=12|صفحات=e0190152|تاريخ=21 December 2017|PMID=29267363|PMCID=5739479|DOI=10.1371/journal.pone.0190152|bibcode=2017PLoSO..1290152C}}</ref> كما هو الحال مع الطرق الأخرى، يتكون القياس من مقارنة مخرجات الأداة مع بعضها البعض ومعاييرgolden المعروف.

تحاليل الدارجة للحصول على قائمة من الجينات المعبر عنها تفاضليًا تأتي في اثنين من النكهات، التحقق من صحة الملاحظات والاستدلال البيولوجي. نظرًا لمخاطر التعبير التفاضلي وRNA-Seq، يتم تكرار الملاحظات المهمة باستخدام (1) طريقة متعامدة في نفس العينات (مثل PCR في الوقت الفعلي) أو (2) تجربة أخرى، مسجلة مسبقًا في بعض الأحيان، في مجموعة جديدة. هذا الأخير يساعد على ضمان التعميم ويمكن متابعته عادةً مع التحليل التلوي لجميع الأفواج المجمعة. الطريقة الأكثر شيوعًا للحصول على فهم بيولوجي عالي المستوى للنتائج هي تحليل التخصيب الجيني، على الرغم من أنه يتم أحيانًا استخدام طرق الجينات المرشحة. يحدد إثراء مجموعة الجينات ما إذا كان التداخل بين مجموعتين من الجينات ذا دلالة إحصائية، وفي هذه الحالة يكون التداخل بين الجينات ومجموعات الجينات التي يتم التعبير عنها تفاضليًا من مسارات / قواعد البيانات المعروفة (مثل، الجينات الأنطولوجية، KEGG، الأنثروبولوجيا البشرية للأنماط) أو من التحليلات التكميلية في التحليل الجيني نفس البيانات (مثل شبكات التعبير المشترك). تشمل الأدوات الشائعة لإثراء مجموعة الجينات واجهات الويب (مثل، ENRICHR، g: profiler) وحزم البرامج. عند تقييم نتائج التخصيب، يكون أحد الأساليب البحثية هو البحث أولاً عن إثراء البيولوجيا المعروفة كتحقق من الصحة ومن ثم توسيع النطاق للبحث عن بيولوجيا جديدة.
[[ملف:Alt_splicing_bestiary2.jpg|يسار|تصغير| انواع الربط ل RNA البديل. يتم تمثيل Exons ككتل زرقاء وصفراء ، والإنترونات كخطوط بينهما.]]

=== الربط البديل ===
الربط بين الحمض النووي الريبي جزء لا يتجزأ من حقيقيات النوى ويسهم بشكل كبير في تنظيم البروتين وتنوعه، حيث يحدث في أكثر من 90 ٪ من الجينات البشرية.<ref name="Alternative splicing and evolution">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Alternative splicing and evolution: diversification, exon definition and function|صحيفة=Nature Reviews. Genetics|المجلد=11|العدد=5|صفحات=345–55|تاريخ=May 2010|PMID=20376054|DOI=10.1038/nrg2776}}</ref> هناك عدة طرق بديلة للتشكيل: تخطي exon وضع الربط الأكثر شيوعًا في البشر ونواة حقيقيات النوى أعلى، exons حصرية متبادلة، ومتبرع بديل أو مواقع متقبلة، والاحتفاظ بالإنترون (وضع الربط الأكثر شيوعًا في النباتات، والفطريات، والبروتوزوا) الموقع (المروج)، والبوليدينيل البديل. أحد أهداف RNA-Seq هو تحديد أحداث الربط البديلة والاختبار إذا كانت تختلف بين الظروف. تسلسل القراءة الطويلة يلتقط النص الكامل، وبالتالي يقلل من العديد من القضايا في تقدير وفرة isoform، مثل تعيين قراءة غامضة. بالنسبة لقراءة RNA-Seq القصيرة، هناك طرق متعددة لاكتشاف الربط البديل الذي يمكن تصنيفه إلى ثلاث مجموعات رئيسية: <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems|صحيفة=BMC Bioinformatics|المجلد=15|العدد=1|صفحات=364|تاريخ=December 2014|PMID=25511303|PMCID=4271460|DOI=10.1186/s12859-014-0364-4}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|الأخير=Pachter|الأول=Lior|عنوان=Models for transcript quantification from RNA-Seq|تاريخ=19 April 2011|لغة=en|arxiv=1104.3889|bibcode=2011arXiv1104.3889P}}</ref> <ref name="Annotation-free quantification of R">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Annotation-free quantification of RNA splicing using LeafCutter|صحيفة=Nature Genetics|المجلد=50|العدد=1|صفحات=151–158|تاريخ=January 2018|PMID=29229983|PMCID=5742080|DOI=10.1038/s41588-017-0004-9}}</ref>

* ''قائم على العد (أيضًا قائم على الأحداث ، الربط التفاضلي):'' تقدير استبقاء الإكسون. ومن الأمثلة على ذلك DEXSeq ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Detecting differential usage of exons from RNA-seq data|صحيفة=Genome Research|المجلد=22|العدد=10|صفحات=2008–17|تاريخ=October 2012|PMID=22722343|PMCID=3460195|DOI=10.1101/gr.133744.111}}</ref> MATS ، <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data|صحيفة=Nucleic Acids Research|المجلد=40|العدد=8|صفحات=e61|تاريخ=April 2012|PMID=22266656|PMCID=3333886|DOI=10.1093/nar/gkr1291}}</ref> و SeqGSEA.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=SeqGSEA: a Bioconductor package for gene set enrichment analysis of RNA-Seq data integrating differential expression and splicing|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=30|العدد=12|صفحات=1777–9|تاريخ=June 2014|PMID=24535097|DOI=10.1093/bioinformatics/btu090}}</ref>
* ''قائم على Isoform (أيضًا وحدات متعددة القراءة ، التعبير التفاضلي isoform)'' : تقدير الوفرة isoform أولاً ، ثم الوفرة النسبية بين الشروط. الأمثلة على ذلك هي Cufflinks 2 <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq|صحيفة=Nature Biotechnology|المجلد=31|العدد=1|صفحات=46–53|تاريخ=January 2013|PMID=23222703|PMCID=3869392|DOI=10.1038/nbt.2450}}</ref> و DiffSplice.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=DiffSplice: the genome-wide detection of differential splicing events with RNA-seq|صحيفة=Nucleic Acids Research|المجلد=41|العدد=2|صفحات=e39|تاريخ=January 2013|PMID=23155066|PMCID=3553996|DOI=10.1093/nar/gks1026}}</ref>
* ''الختان على أساس Intron:'' حساب الربط البديل باستخدام تقسيم القراءة. ومن الأمثلة على ذلك MAJIQ <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=A new view of transcriptome complexity and regulation through the lens of local splicing variations|صحيفة=eLife|المجلد=5|صفحات=e11752|تاريخ=February 2016|PMID=26829591|PMCID=4801060|DOI=10.7554/eLife.11752}}</ref> و Leafcutter. <ref name="Annotation-free quantification of R" />

يمكن أيضًا استخدام أدوات التعبير الجيني التفاضلي للتعبير التفاضلي isoform إذا تم قياس الأشكال الإسوية مسبقًا مع أدوات أخرى مثل RSEM.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies|صحيفة=Briefings in Bioinformatics|المجلد=20|العدد=2|صفحات=471–481|تاريخ=March 2019|PMID=29040385|DOI=10.1093/bib/bbx122}}</ref>

=== شبكات التعبير (النسخ) المساعد ===
شبكات التعبير (النسخ) المساعد هي تمثيلات مستمدة من البيانات من الجينات تتصرف بطريقة مماثلة عبر الأنسجة والظروف التجريبية.<ref name="marcotte1999">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=A combined algorithm for genome-wide prediction of protein function|صحيفة=Nature|المجلد=402|العدد=6757|صفحات=83–6|تاريخ=November 1999|PMID=10573421|DOI=10.1038/47048|bibcode=1999Natur.402...83M}}</ref> يكمن هدفهم الرئيسي في توليد الفرضيات وأساليب الذنب من جانب الجمعيات لاستنتاج وظائف الجينات غير المعروفة سابقًا. تم استخدام بيانات RNA-Seq لاستنتاج الجينات المشاركة في مسارات محددة تعتمد على ارتباط بيرسون، سواء في النباتات <ref name="giorgi2013">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Comparative study of RNA-seq- and microarray-derived coexpression networks in Arabidopsis thaliana|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=29|العدد=6|صفحات=717–24|تاريخ=March 2013|PMID=23376351|DOI=10.1093/bioinformatics/btt053}}</ref> والثدييات.<ref name="iancu2012">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Utilizing RNA-Seq data for de novo coexpression network inference|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=28|العدد=12|صفحات=1592–7|تاريخ=June 2012|PMID=22556371|PMCID=3493127|DOI=10.1093/bioinformatics/bts245}}</ref> الميزة الرئيسية لبيانات RNA-Seq في هذا النوع من التحليل عبر منصات ميكروأري هي القدرة على تغطية النص بأكمله، مما يتيح إمكانية كشف تمثيلات أكثر اكتمالا لشبكات تنظيم الجينات. يمكن الكشف عن التنظيم التفريقي لعناصر الشكل العظمية للجنس نفسه واستخدامها للتنبؤ ووظائفها البيولوجية.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Systematically differentiating functions for alternatively spliced isoforms through integrating RNA-seq data|صحيفة=PLoS Computational Biology|المجلد=9|العدد=11|صفحات=e1003314|تاريخ=Nov 2013|PMID=24244129|PMCID=3820534|DOI=10.1371/journal.pcbi.1003314|bibcode=2013PLSCB...9E3314E}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=The emerging era of genomic data integration for analyzing splice isoform function|صحيفة=Trends in Genetics|المجلد=30|العدد=8|صفحات=340–7|تاريخ=August 2014|PMID=24951248|PMCID=4112133|DOI=10.1016/j.tig.2014.05.005}}</ref> تم بنجاح استخدام تحليل شبكة التعبير المشترك للجينة الموزونة لتحديد الوحدات النمطية للتعبير المشترك والجينات المحورية داخل العضل على بيانات الحمض النووي الريبي. قد تتوافق وحدات التعبير المشترك مع أنواع الخلايا أو المسارات. يمكن تفسير لوحات الوصل الفائقة المتصلة ببعضها البعض كممثلين لوحدة كل منها. إن eigengene هو عبارة عن مجموع مرجح للتعبير عن جميع الجينات في وحدة نمطية. Eigengenes هي علامات حيوية مفيدة (ميزات) للتشخيص والتشخيص.<ref name="Pigegene">{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Large-scale gene network analysis reveals the significance of extracellular matrix pathway and homeobox genes in acute myeloid leukemia: an introduction to the Pigengene package and its applications|صحيفة=BMC Medical Genomics|المجلد=10|العدد=1|صفحات=16|تاريخ=March 2017|PMID=28298217|PMCID=5353782|DOI=10.1186/s12920-017-0253-6}}</ref> تم اقتراح مناهج تحويل التباين المستقر لتقدير معاملات الارتباط بناءً على بيانات RNA seq.

=== اكتشاف البديل ===
يلتقط RNA-Seq تباين الحمض النووي، بما في ذلك متغيرات النوكليوتيدات الفردية والإدخالات الصغيرة / الحذف. والتباين الهيكلي. يشبه استدعاء المتغير في RNA-Seq استدعاء متغير الحمض النووي، وغالبًا ما يستخدم نفس الأدوات (بما في ذلك SAMtools mpileup <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=The Sequence Alignment/Map format and SAMtools|صحيفة=Bioinformatics|المجلد=25|العدد=16|صفحات=2078–9|تاريخ=August 2009|PMID=19505943|PMCID=2723002|DOI=10.1093/bioinformatics/btp352}}</ref> و GATK HaplotypeCaller <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data|صحيفة=Nature Genetics|المجلد=43|العدد=5|صفحات=491–8|تاريخ=May 2011|PMID=21478889|PMCID=3083463|DOI=10.1038/ng.806}}</ref>) مع تعديلات لحساب الربط. أحد الأبعاد الفريدة لمتغيرات الحمض النووي الريبي هو التعبير الخاص بالأليل (ASE): قد يتم التعبير عن المتغيرات من النمط الفرداني واحد بشكل تفضيلي بسبب التأثيرات التنظيمية بما في ذلك البصمة والتعبير عن موقع السمات الكمية، والمتغيرات النادرة غير المشفرة.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Genetic effects on gene expression across human tissues|صحيفة=Nature|المجلد=550|العدد=7675|صفحات=204–213|تاريخ=October 2017|PMID=29022597|PMCID=5776756|DOI=10.1038/nature24277|bibcode=2017Natur.550..204A}}</ref> <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=ORE Identifies Extreme Expression Effects Enriched for Rare Variants|صحيفة=Bioinformatics|تاريخ=March 2019|PMID=30903145|DOI=10.1093/bioinformatics/btz202}}</ref> تتضمن حدود تحديد متغير الحمض النووي الريبي (RNA) أنه يعكس فقط المناطق المعبر عنها (عند البشر، <5٪ من الجينوم) ولديه جودة أقل مقارنة بتسلسل الحمض النووي المباشر.

==== تحرير الحمض النووي الريبي (التعديلات بعد النسخ) ====
يمكن أن يساعد وجود تسلسلات مطابقة للجينوم والنسخ للفرد في الكشف عن التعديلات بعد النسخ (تحرير RNA). <ref name="wang2009" /> يتم تحديد حدث تعديل ما بعد النسخ إذا كان نص الجين يحتوي على أليل / متغير لم يلاحظ في البيانات الجينية.
[[ملف:RNA-Seq-fusion-gene.png|تصغير| تعيين RNA-Seq للقراءات القصيرة على تقاطعات exon-exon ، اعتمادًا على المكان الذي تعين فيه كل نهاية ، يمكن تعريفه بأنه حدث ''Trans'' أو ''Cis'' .]]

=== كشف الجينات الانصهار ===
بسبب التعديلات الهيكلية المختلفة في الجينوم، اكتسبت جينات الاندماج الانتباه بسبب علاقتها بالسرطان.<ref name="teixeira2006">{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Recurrent fusion oncogenes in carcinomas|صحيفة=Critical Reviews in Oncogenesis|المجلد=12|العدد=3–4|صفحات=257–71|تاريخ=December 2006|PMID=17425505|DOI=10.1615/critrevoncog.v12.i3-4.40}}</ref> إن قدرة RNA-Seq على تحليل النص الكامل للعينة بطريقة غير متحيزة تجعلها أداة جذابة للعثور على هذه الأنواع من الأحداث الشائعة في السرطان. <ref name="maher2009" />

وتأتي الفكرة من عملية محاذاة القراءات النصية القصيرة إلى الجينوم المرجعي. ستقع معظم القراءات القصيرة ضمن إكسون واحد كامل، ومن المتوقع أن تحدد مجموعة أصغر ولكن لا تزال كبيرة على تقاطعات إكسون المعروفة. عندئذٍ، سيتم تحليل القراءات القصيرة المتبقية غير المعينة لتحديد ما إذا كانت تتطابق مع تقاطع إكسون حيث يأتي الإكسون من جينات مختلفة. قد يكون هذا دليلًا على حدوث اندماج محتمل، ولكن نظرًا لطول القراءات، فقد يكون هذا مزدحم للغاية. هناك طريقة بديلة تتمثل في استخدام قراءات نهاية الزوج، عندما يقوم عدد كبير يحتمل من القراءات المقترنة بتعيين كل طرف إلى إكسون مختلف، مما يوفر تغطية أفضل لهذه الأحداث ومع ذلك، فإن النتيجة النهائية تتكون من مجموعات متعددة وربما جديدة من الجينات توفر نقطة انطلاق مثالية لمزيد من التحقق من الصحة. 

== التاريخ ==
[[ملف:RNAseq_over_time_(Pubmed).png|يسار|تصغير| لا يزال عدد المخطوطات في PubMed الذي يضم RNA-Seq في ازدياد.]]
تم تطوير RNA-Seq لأول مرة في منتصف عام 2000 مع ظهور تقنية التسلسل من الجيل التالي.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Discovering New Biology through Sequencing of RNA|صحيفة=Plant Physiology|المجلد=169|العدد=3|صفحات=1524–31|تاريخ=November 2015|PMID=26353759|PMCID=4634082|DOI=10.1104/pp.15.01081}}</ref> تتضمن المخطوطات الأولى التي استخدمت RNA-Seq حتى بدون استخدام المصطلح تلك الخاصة بخطوط خلايا [[سرطان البروستاتا]] <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|إظهار المؤلفين=6|عنوان=Analysis of the prostate cancer cell line LNCaP transcriptome using a sequencing-by-synthesis approach|صحيفة=BMC Genomics|المجلد=7|صفحات=246|تاريخ=September 2006|PMID=17010196|PMCID=1592491|DOI=10.1186/1471-2164-7-246}}</ref> (بتاريخ 2006)، و ''[[فصة برميلية|Medicago truncatula]]'' <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Sequencing Medicago truncatula expressed sequenced tags using 454 Life Sciences technology|صحيفة=BMC Genomics|المجلد=7|صفحات=272|تاريخ=October 2006|PMID=17062153|PMCID=1635983|DOI=10.1186/1471-2164-7-272}}</ref> (2006)، [[ذرة (نبات)|والذرة]] <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Gene discovery and annotation using LCM-454 transcriptome sequencing|صحيفة=Genome Research|المجلد=17|العدد=1|صفحات=69–73|تاريخ=January 2007|PMID=17095711|PMCID=1716268|DOI=10.1101/gr.5145806}}</ref> (2007)، و ''[[رشاد أذن الفأر|Arabidopsis thaliana]]'' <ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=Sampling the Arabidopsis transcriptome with massively parallel pyrosequencing|مسار=https://archive.org/details/sim_plant-physiology_2007-05_144_1/page/32|صحيفة=Plant Physiology|المجلد=144|العدد=1|صفحات=32–42|تاريخ=May 2007|PMID=17351049|PMCID=1913805|DOI=10.1104/pp.107.096677}}</ref> (2007)، في حين أن مصطلح "RNA-Seq" نفسه ذكر لأول مرة في عام 2008.<ref>{{استشهاد بدورية محكمة|عنوان=The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing|صحيفة=Science|المجلد=320|العدد=5881|صفحات=1344–9|تاريخ=June 2008|PMID=18451266|PMCID=2951732|DOI=10.1126/science.1158441|bibcode=2008Sci...320.1344N}}</ref> يزداد عدد المخطوطات التي تشير إلى RNA-Seq في العنوان أو الملخص (الشكل ، الخط الأزرق) بشكل مستمر مع 6754 مخطوطة نشرت في عام 2018 ([https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=%22RNA+Seq%22+OR+%22RNA-Seq%22+OR+%22RNA+sequencing%22+OR+%22RNASeq%22 رابط للبحث في PubMed]). تقاطع RNA-Seq والدواء (الشكل ، الخط الذهبي ، [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=(%22RNA+Seq%22+OR+%22RNA-Seq%22+OR+%22RNA+sequencing%22+OR+%22RNASeq%22)+AND+%22Medicine%22 رابط البحث في النشرات] الطبية [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=(%22RNA+Seq%22+OR+%22RNA-Seq%22+OR+%22RNA+sequencing%22+OR+%22RNASeq%22)+AND+%22Medicine%22 PubMed]) له مرونة مماثلة.   <sup class="noprint Inline-Template" style="white-space:nowrap;">&#x5D;</sup>
<sup class="noprint Inline-Template" data-ve-ignore="true" style="white-space:nowrap;">&#x5B; ''[[أرابيكا:لا أبحاث أصيلة|<span title="The material near this tag possibly contains original research. (July 2019)">البحث الأصلي؟</span>]]''</sup>

=== تطبيقات على الطب ===
RNA-Seq لديه القدرة على تحديد البيولوجيا المرضية الجديدة ، المؤشرات الحيوية الشخصية للمؤشرات السريرية ، استنتاج مسارات قابلة للتخدير ، وجعل التشخيص الوراثي. يمكن تخصيص هذه النتائج بشكل أكبر للمجموعات الفرعية أو حتى للمرضى الأفراد، مما قد يؤدي إلى تسليط الضوء على المزيد من الوقاية الفعالة والتشخيص والعلاج. تملي جدوى هذا النهج جزئياً التكاليف في المال والوقت؛ أحد القيود ذات الصلة هو فريق المتخصصين المطلوب (خبراء المعلومات الحيوية والأطباء / الأطباء والباحثون الأساسيون والفنيون) لتفسير كامل الكم الهائل من البيانات الناتجة عن هذا التحليل.

=== جهود التسلسل الجيني على نطاق واسع ===
تم التركيز بشكل كبير على بيانات RNA-Seq بعد أن استخدمت مشاريع موسوعة عناصر الحمض النووي (ENCODE) وأطلس سرطان الجينوم (TCGA) هذا النهج لتوصيف عشرات من خطوط الخلايا <ref>{{استشهاد ويب
| مسار = http://genome.ucsc.edu/ENCODE/dataMatrix/encodeDataMatrixHuman.html
| عنوان = ENCODE Data Matrix
| موقع = 
| تاريخ الوصول = 2013-07-28
|مسار أرشيف= https://web.archive.org/web/20190530102038/http://genome.ucsc.edu:80/ENCODE/dataMatrix/encodeDataMatrixHuman.html|تاريخ أرشيف=2019-05-30}}</ref> وآلاف من عينات الورم الأولية، <ref>{{استشهاد ويب
| مسار = https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga
| عنوان = The Cancer Genome Atlas - Data Portal
| موقع = 
| تاريخ الوصول = 2013-07-28
|مسار أرشيف= https://web.archive.org/web/20160416053541/https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp|تاريخ أرشيف=2016-04-16}}</ref> على التوالي. تهدف ENCODE إلى تحديد المناطق التنظيمية على نطاق الجينوم في مجموعة مختلفة من خطوط الخلايا والبيانات transcriptomic هي الأهم من أجل فهم تأثير المصب لتلك الطبقات التنظيمية الجينية والوراثية. يهدف TCGA، بدلاً من ذلك، إلى جمع وتحليل آلاف من عينات المرضى من 30 نوعًا مختلفًا من الأورام من أجل فهم الآليات الأساسية للتحول والتطور الخبيث. في هذا السياق، توفر بيانات RNA-Seq لقطة فريدة للحالة النصية للمرض وتنظر إلى مجموعة غير متحيزة من النصوص التي تسمح بتحديد النصوص الجديدة ونصوص الاندماج وRNA غير المشفرة التي يمكن اكتشافها باستخدام تقنيات مختلفة.

== المراجع ==
{{مراجع}}

<references group="" responsive="0"></references>
{{شريط بوابات|علم الأحياء الخلوي والجزيئي}}
{{مصادر طبية}}

[[تصنيف:تعبير جيني]]
[[تصنيف:حمض نووي ريبوزي]]
[[تصنيف:علم الأحياء الجزيئي]]